转基因玉米荧光现场可视化检测方法

  近日，浙江省农业科学院发表文献，利用LUYOR-3415RG便携式荧光蛋白激发光源对转基因玉米双抗的可视化检测。文献摘要如下：

转基因玉米双抗 12-5 具有良好的抗虫性和除草剂耐受性，是我国批获得安全证书的转基因 玉米之一，具有广阔的应用前景。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）建立转基因玉米双抗 12-5 的现场快速检测方法。

针对转基因玉米双抗 12-5 的转 化体特异性序列片段，设计引物和探针，通过引物筛选实验得到更佳引物与探针组合。荧光 RPA 扩增 结果可以在蓝光（LUYOR-3415RG）下直接进行可视化分析。结果表明，建立的转基因玉米双抗 12-5 可视化检测体系特异 性强，检测灵敏度达到 10 拷贝。进一步研究发现 RPA 的扩增体系对温度有很强的适应性，样品在 34℃ ~46℃之间都能得到扩增，据此，本研究利用市面上常见的自发热暖贴代替常规的加热仪器来激发 RPA。 结果表明，自发热暖贴满足 RPA 扩增体系对温度的需要。

最终，本研究将自发热暖贴加热法与 RPA 可 视化检测体系结合，对转基因玉米双抗 12-5 进行现场检测，并与 qPCR 方法检测结果作比较，检测结果表明，本研究建立的现场可视化检测方法与 qPCR 方法检测结果一致，并且可视化检测方法时间短， 检测结果清晰易分辨。本研究建立的转基因玉米双抗 12-5 现场快速可视化检测方法，其特异性强、灵敏度高、方便、快捷，不仅满足了转基因玉米双抗 12-5的现场快速检测的需要，也为其他现场快速检测方法的开发提供了新思路。

1 材料与方法 

1.1 材料 转基因玉米双抗 12-5 种子，转基因玉米 NK603、BT176、T25 和 BT11，转基因大豆 A5547-127、356043、GTS40-3-2 和 FG72，转基因油菜 MS1×RF1、MS2×RF2、MS8×RF3 和 OXY235，转基因棉花 LLcotton25、MON15985 和 GHB119 的 DNA 均来自本实验室。 

1.2 DNA 提取 按照植物 DNA 提取试剂盒（杭州新景生物试剂开发有限公司）说明书提取各样品的基 因组 DNA，所提取的 DNA 用核酸蛋白测定仪 NanoDrop2000C（美国 Thermo 公司）进行核 酸质量分析，并置于-20℃贮存备用。 

1.3 荧光 RPA 参照 RPA（荧光型）试剂盒（潍坊安普未来生物科技有限公司）说明书进行体系配置， 荧光 RPA 反应体系为 50 μL：Buffer A 12.5 μL，10 μmol/L 正、反向引物各 2 μL，10 μmol/L 探针 0.6 μL，模板 DNA 2 μL，加 ddH2O 补齐到 47.5 μL，充分混匀后加入 Buffer B 2.5 μL， 再次混匀。荧光 RPA 反应条件：39℃扩增 20 min。荧光 RPA 的实时荧光信号用荧光定量 PCR 仪 CFX96（美国伯乐公司）观察，荧光 RPA 的可视化结果用手持蓝光灯（LUYOR-3415RG，路阳仪器）照射并在黄色滤镜下拍照观察。 

1.4 引物与探针设计 荧光 RPA 体系包括 2 条引物和 1 条探针，转基因玉米双抗 12-5 的载体示意图及扩增的 转化体特异性序列信息见图 1A。利用 Vector NTI 软件在外源插入位点的左侧即转基因玉米 基因组序列设计上游引物 8 条，在外源插入位点的右侧即外源插入片段序列设计下游引物 8 条。所设计的上、下游引物分别处于外源插入位点的两侧，以保证对转基因玉米双抗 12-5 的 特异性扩增。引物长度 30~35 bp，GC 含量占 30%~70%[13]。所设计探针包含玉米基因组和 外源片段的序列，长度 46~52 bp，并避免回文序列、内部二级结构和连续重复碱基。探针共 有 4 个修饰位点，在距离 5'端中间部位，第 31 个碱基 G 处标记一个四氢呋喃（THF）碱基 类似物，作为核酸外切酶的识别位点；在 THF 位点的上游，第 30 个碱基 T 处标记一个荧光 基团（FAM:6-羧基荧光素），在 THF 位点的下游，第 33 个碱基 T 处标记一个淬灭基团（BHQ: 荧光猝灭基团），两基团的间距为 1~5 bp；THF 位点距离 3'末端至少 15 bp 长度，并在 3'末 端标记一个修饰基团。只有当探针与序列成功配对时，THF 位点才会被外切酶切割，使荧光 基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号（图 1B）。 转基因玉米双抗 12-5 的普通 PCR 引物和 qPCR 引物引用标准[14]，本研究所用的引 物和探针配制为 10 μmol/L。所有引物和探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成， 引物和探针信息见表 1。 

1.5 引物筛查 用上游引物 F1 分别与所有下游引物组合，结合探针，对转基因玉米双抗 12-5 进行实时 荧光 RPA 检测实验，分析结果，选出其中扩增效率更高的下游引物，再用这条下游引物分 别与所有上游引物组合，结合探针，对转基因玉米双抗 12-5 进行实时荧光 RPA 检测实验， 选择扩增效率更高的一组，作为最终的检测引物组合。

RRC平台实样现场检测

为评估RRC平台在真实样品现场检测中的适用性，以96颗大豆的96片叶片作为真实样品。一个简短的工作流程展示在图 3A. 所有 DNA 均通过 RDEM 提取，并用作 RT-PCR 和 RAA 的模板。RRC平台的视觉荧光结果表明，从96个样品中检测到22个SHZD32-1。带有SHZD32-1的试管中呈现亮绿色荧光。因此很容易与其他没有 SHZD32-1 的管区分开来（图 1B）。此外，使用荧光成像系统（ChemiDoc Imaging System，Bio-Rad，美国）分析 RRC 平台的 96 孔板。在这些管中观察到白色荧光（图 1B）。这一结果意味着手持荧光灯(LUYOR-3415RG)的可视化结果可以与大型专业仪器的观察结果相媲美。此外，RRC平台和RT-PCR的现场检测结果一致。96份样本经RT-PCR检测，同样22份样本为SHZD32-1，22份样本的Ct值与扩增曲线一起给出（图 1C）。这些发现表明，RRC 平台对于目标核酸的现场检测具有高度的准确性。

文献全文下载地址：

Frontiers | A Fast, Visual, and Instrument-free Platform Involving Rapid DNA Extraction, Chemical Heating, and Recombinase Aided Amplification for On-Site Nucleic Acid Detection | Bioengineering and Biotechnology (frontiersin.org)

LUYOR-3415RG便携式荧光蛋白激发光源产品介绍：